最常用的5款阳离子脂质你了解多少？AVT给您提供详细的阳离子脂质介绍
文章来源：AVT发布时间：2020-09-11浏览次数：
最常用的5款阳离子脂质你了解多少？AVT给您提供详细的阳离子脂质介绍,快来了解一下吧！
自DNA重组技术诞生，以重组DNA技术为核心的现代生物技术产业蓬勃发展，已有十多个基因工程药物上市。以基因工程药物为主的各种基因工程产品和细胞工程产品陆续商品化。在基因治疗中，基因载体是外源基因得以进入受体细胞的关键，其中，阳离子脂质体目前被认为是靶向性好，副作用小，稳定性好和转染效率较高的理想载体。阳离子脂质体通常由一种阳离子脂质和中性辅助脂质在适当的条件下复合而成，阳离子脂质体转染效率与阳离子脂质的组成密切相关。
阳离子脂质分子在结构上由三个部分组成：一个或多个阳离子头部（head）、连接键（linker bond）和疏水尾部（hydrophobic tail）。
阳离子脂质的头部大都包含胺类基团（除脂质含脒基外），从简单的氨基到被甲基或羟乙基团取代的季铵盐。阳离子脂质的极性头起着脂质体与DNA、脂质体-DNA复合物与细胞膜或细胞内其它组分相互结合的作用。在阳离子胆固醇衍生物中，带有叔胺基团的阳离子胆固醇化合物比季铵盐化合物有更高的转染活力，并且毒性小得多。带有多价极性头基团或具有多个正电荷极性头的阳离子脂质体转染效率较高，这可能是因为它与DNA的结合较牢固，且更易实现内涵体逃逸。
连接链的长度能影响阳离子脂质体与细胞膜的相互作用，从而影响转染活力。一般来说，带有长连接链的阳离子脂质体能显著增强与细胞膜的相互作用，转染效率高。
连接键是类脂分子很重要的组成部分，它决定了阳离子脂质体的化学稳定性和生物可降解性。醚键和C-N键的化学稳定性较高，但不易被生物降解，一般不适用于体内实验；含有酯键的阳离子脂质体较易被生物降解，细胞毒性小，但它们的化学稳定性通常较差。通常采用的连接键是化学稳定性较高、但又可以生物降解的酰胺键和氨甲酰键等。
常见的阳离子脂质体的疏水尾部主要有脂肪烃链和胆固醇环。脂肪烃链的碳原子数通常为12至18个，以达到在生理温度下为脂双层提供足够的流动性，又能使脂双层膜维持一定的刚性，以便为阳离子脂质体在体内的脂质融合创造条件。对以脂肪链为尾部的脂质体，碳链加长会导致转染效率降低，但在链内引入不饱和键可提高效率。将胆固醇用作疏水尾部，效果常常优于脂肪链，因为由它参与形成的双分子层结构更稳定。
Dlin-MC3-DMA
2018年全球首个用于治疗治疗家族性淀粉样多发性神经病变的siRNA脂质体产品Onpattro在美上市，成功打开了沉默细胞基因药物的大门。
▲Onpattro
Onpattro中运用的阳离子脂质材料DLin-MC3-DMA也开始备受关注。在这之前，DLin-MC3-DMA在国内市场仍是一片空白。AVT基于深耕磷脂、脂质体、脂肪乳方向多年的资源和经验，推出新产品DLin-MC3-DMA。为阳离子脂质材料提供了一种“低毒高效”选择。
▲ Onpattro中各组分的具体用量
DLin-MC3-DMA作为新型阳离子脂质——可电离化阳离子脂质的代表，具有“低毒高效”的优势，它的化学名为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸 (6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C43H79NO2，是一种无色至淡黄色的油状液体，pKa=6.44。
▲DLin-MC3-DMA结构式
DLin-MC3-DMA具有独特的pH依赖性电荷可变特性：酸性条件下呈正电性，而生理pH条件下呈电中性。它在Onpattro中的成功应用，成为Alnylam对于siRNA递送技术的关键，是制备肝脏靶向siRNA/LNP系统的“标准”脂质材料。
DLin-MC3-DMA产品信息
1、产品名称：DLin-MC3-DMA
2、化学名称：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯
(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl4-(dimethylamino)butanoate
3、分子式：C43H79NO2
4、生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司
5、CAS号：1224606-06-7
6、用途：阳离子脂质体
7、性状：无色至淡黄色油状液体
8、纯度：≥98%
9、溶解性：不溶于水，易溶于DMSO、甲醇、乙醇。
10、分子量：642.09
11、保存条件：-20℃
12、注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触
DLin-MC3-DMA图谱信息
DMG-PEG2000
随着新冠肺炎mRNA疫苗的火热研制而被大家认识的脂质新材料DMG-PEG2000迅速蹿红。许多小伙伴只知道DMG-PEG2000和DSPE-mPEG2000一样具有长循环作用且基因转染效果更好，却并不了解背后的具体原理。本期小编就给大家简单讲解一下这类以DMG-PEG2000为代表的新型PEG化脂质的应用优势。
DMG-PEG2000英文全名1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，中文名可对应翻译为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式为C122H242O50，分子量2509.2（平均值），代表结构如下：
从结构式上就能看出，该材料是通过PEG化修饰了一种短链脂质，C14比常见的DSPE-mPEG2000的C18链短得多，这样最直接的结果就是脂质“锚”嵌插入脂质膜较“浅”，在体循环过程中较易脱落。而这一设计最大的优势是解决了“PEG-dilemma”。PEG-dilemma 主要有三点：
1、 PEG链的空间位阻作用屏蔽脂质体与细胞膜间的相互作用，抑制靶细胞对脂质体的摄取；
2、 屏蔽脂质体与内涵体膜间的相互作用，妨碍 “内涵体逃逸”，导致 RNA被降解无法顺利进入细胞质；
3、 多次注射 PEG 化脂质体诱发免疫反应，引起加速血液清除（ABC）现象。一般的解决办法有：降低脂质体表面 PEG 的密度；使用可断裂的 PEG-脂质间linker，如酯键、腙键、肽键；使用短链脂质，如采用C14脂质锚定较C18更易于 PEG 从粒子表面解离。另外，DMG-PEG2000的短链（肉豆蔻酸，C14）比长链（硬脂酸，C18）半衰期小可更快降解，DMG-PEG2000可降低脂质体与细胞间的相互作用及吸附ApoE的能力，获得最好的细胞基因沉默效果。
“溶酶体/内涵体逃逸”是RNA类药物递送的关键也是难点，药效高低与其直接相关。使用含有短烷基链的聚乙二醇脂质，可在实现体内逃逸的同时快速解离，以此对抗PEG化造成的“内涵体逃逸”失败现象。这也是为何DSPE-mPEG2000在化药脂质体中常用而核酸类脂质体药物使用DMG-PEG2000的基因沉默/表达水平更高、药效最好。
DMG-PEG2000基本信息
1、产品名称：DMG-PEG2000
2、化学名称：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000
3、生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司
4、CAS号：160743-62-4
5、分子式：C32H62O5(C2H4O)n, n≈45
6、用途：阳离子脂质体
7、性状：白色粉末
8、溶解性：易溶于甲醇、氯仿，部分溶于水。
9、分子量：约2509.2
10、纯度：≥98%
11、保存条件：-20℃
12、注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触
DMG-PEG2000图谱信息
▼ H NMR
▼ C NMR
DOTAP及其安全性
阳离子脂质体是基因治疗中研究最多的一种载体，作为非病毒载体，其与病毒载体相比具有以下优势：
保护治疗基因在体内循环中不被降解。通过对脂质体的表面基团进行特殊修饰后的阳离子脂质体能很好地包封DNA片段，促进复合物与细胞膜的融合，增加DNA的摄取和表达；
高效穿过细胞膜和核膜，转染细胞，使其表达/沉默基因；
如果适应症为癌症，则能够选择性的吸附于带负电荷的新生肿瘤血管内皮细胞上，抗癌效果更好。
在阳离子脂质体的研究中使用最多的阳离子脂质就是DOTAP了。它是两亲分子，主要由三部分组成：极性头部(亲水基团)、连接键、疏水尾部。
通过静电作用与带有负电荷的DNA分子相结合的是DOTAP的极性头部，通常由叔胺或季铵盐构成，后来又研究出咪唑头部、氨基酸头部等。其极性头部对核酸分子的包载效率以及细胞毒性均有重要的影响。处方中DOTAP用量越大载药量越大，但zeta电位过高细胞毒性也越大，制剂安全性受影响，两者需平衡。
目前DOTAP较为成功的应用案例有紫杉醇阳离子脂质体EndoTAG-1以及喜树碱药物的阳离子脂质体EndoTAG-2，其作为优秀的转染试剂应用也很广泛。
DOTMA
DOTMA作为一种性能优秀的阳离子脂质材料被广泛应用于非病毒基因转染，如Invitrogen的转染试剂Lipofectin。相较于DOTAP、DC-CHOL、DODMA等，它在拥有更高转染效率的同时细胞毒性也更小，因此在药用阳离子脂质体开发中的研究也越来越多。
DOTMA分子结构上具有“较大尾扇，较小头部”的特性，在脂质体微观形态、体内稳定性以及与细胞膜相作用等方面较DC-CHOL、DEPC等更好。DOTAP也具有类似的结构性质，但DOTAP对DNA/RNA的包载效率不如DOTMA，在同等药效下DOTAP剂量要比DOTMA高得多，随之而来的细胞毒性也就更大，安全性不如DOTMA。RNA脂质体的效果与其所用阳离子脂质的饱和度（双键数量）、侧链长度、头部基团、N价态等因素密切相关，DOTMA正是综合了这几方面的优势，因此具有很好的应用特性。一般处方设计时与胆固醇、PC类磷脂和PEG化脂质合用。
图表引用自：R Kolašinac, C Kleusch. Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(2), 346.
DOTMA其它应用优缺点整理
优点
对核酸包载效率高，RNA/DOTMA脂质复合物中RNA包封率可达100%；
基因转染效率高，某些细胞上能高出DOTAP处方10倍多；
细胞毒性较小，安全性好；
可GMP大规模生产。
缺点
价格较高；
转染效率不如DLin-MC3-DMA等可电离阳离子脂质；
目前仍处于实验室研究阶段，没有上临床的产品。
DOPE为何经常出现在阳离子脂质处方中
阳离子脂质体可与大分子DNA形成复合物，极大压缩DNA分子体积，从而有效进入细胞进行转染，又能避免病毒载体可能带给病人的免疫毒性，因此是安全有效的基因治疗载体。DOTAP（溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵）、DOTMA（氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵）、DC-Chol（3β-[N-（N’，N’-二甲基胺乙基）胺基甲酰基]胆固醇）是较为常用的阳离子脂质，但单独形成脂质体稳定性、膜融合性、转染效率差，所以常需要添加辅助脂质。其中DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）是最为常用的辅助脂质，比使用DOPC（二油酰磷脂酰胆碱）、CHO（胆固醇）脂质体的融合性、转染效率均高。
一般来说，正常的阳离子脂质体处方中需含有阳离子脂质、胆固醇、中性助磷脂以及PEG化磷脂，各种脂质成分的选择经常是因项目不同而各异，但在查阅文献过程中大家都会发现一个共同点，那就是处方中常出现DOPE的身影，这是为什么呢？
DOPE可说是非常常用的助磷脂（helper lipid），在制备阳离子脂质体过程中具有很强的协同作用，主要原理如下：
中性不稳定助类脂：起稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用。
干扰类脂膜，使内涵体膜不稳定：在细胞内能促进DNA、RNA的释放，同时辅助阳离子脂质体的细胞渗透。
能够确定核酸+脂质体复合物的形态，可是脂质体结构从多相Lα相跃迁到六角HII相，使复合物具有良好的可融性，能显著提高跨膜效率。
因此，DOPE的加入可使得阳离子脂质体膜融合更好、稳定性更高、细胞毒性更小。大量研究表明类脂聚合物单独作用时不能转染细胞，而加入DOPE能解决这个问题，比如使用DC-Chol/DOPE可表达CAT基因，而复合物DC-Chol/DOPC则没有活性。
胆固醇CHO-HP
CHO-HP为注射用脂质体专用辅料，可增强脂质体膜稳定性，减少药物渗漏，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力。活性高的阳离子脂质一般都含有2个以上双键，体内稳定性较差因此需要较高的胆固醇用量。
CHO-HP是在cGMP条件下生产的高纯度注射级药用辅料，DMF号：024780，药用辅料登记号：F20170000106（A）。与国内惯用的动物组织提取法生产胆固醇不同，CHO-HP是以羊毛油脂为原料，采用半合成方法制得，纯度高（>99%），且不会有动物组织的病毒污染问题，在国际上多个上市脂质体产品中长期应用。
CHO-HP为白色粉末状固体，室温下稳定性较好，但对光敏感，因此应该避光、封闭保存，保存得当，有效期可达5年。本品在三氯甲烷中易溶（1g/4.5ml），在乙醚中溶解（1g/2.8ml），在丙酮、乙酸乙酯或石油醚中略溶，在乙醇中微溶，在水中不溶（0.2mg/100ml）。
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