艾伟拓分享:针对病毒感染和多种肿瘤的RNA类疫苗也已经进入临床前期和临床试验阶段

文章来源:AVT发布时间:2020-08-28浏览次数:

 本期艾伟拓给您分享RNA类药物以及疫苗的研究进展,针对病毒感染和多种肿瘤的RNA类疫苗也已经进入临床前期和临床试验阶段,感兴趣的小伙伴速来围观!

 以mRNA和RNA病毒为基础研制的药物和疫苗展现出巨大潜能并能在细胞质内直接翻译而减少染色体整合。但其应用仍受RNA降解相关的转运及稳定性问题的限制。基于RNA类药物的临床试验已经在多个疾病领域展开。同时针对病毒感染和多种肿瘤的RNA类疫苗也已经进入临床前期和临床试验阶段。RNA转运和稳定性的提升,包括RNA结构改造,靶向树突状细胞和自体扩增RNA的应用。单链RNA病毒包含自体扩增RNA,使它可以在细胞质中产生大量RNA复制体来支持RNA类药物和疫苗的发展。尽管寡核苷酸类方法也展现了其潜力,但在这篇文章中我们主要关注以mRNA和RNA病毒为基础的方法。

 药物发展长期以来被疗效不佳,不良反应和高昂费用等问题困扰。因此,药物研发的新方法一直很受重视。RNA为基础的方法为研制靶向针对受累细胞的药物和针对免疫反应刺激细胞的疫苗提供了优势。临床试验中,RNA药物在治疗眼部疾病,心血管疾病和多种肿瘤方面有所成效。同时,已经证实在动物模型中RNA疫苗对致死剂量的埃博拉病毒和肿瘤细胞有保护作用。

 背景介绍

 现代药物研制因转运不充分,药物疗效和安全等问题而无法改进或发明新药。相比传统制药方法,小分子药物和生物疗法的发展以及将核酸的应用有很大的发展潜力。这篇文章中,胞质DNA和寡核苷酸类药物也有所涉及。然而,近期技术发展为应用RNA类药物的研制创造了可能。直接方法包括将以在靶细胞内迅速翻译来表达有治疗效果基因的疗效或者生成可以用来制作疫苗的抗原为目的mRNA注入细胞。由于RNA序列的出现,转运进入细胞的转录片段因被快速降解而只能得到非常有限的暂时转录表达并且削弱了疗效。为提高RNA的稳定性,我们付出了很大的努力。同样,转运RNA的问题也备受关注,转运的方法包括:用磷脂分子、聚合物或者纳米粒子来包裹RNA分子以及靶向树突状细胞(DCs)也就是抗原呈递细胞。另一种方案中,以RNA病毒为基础的自体扩增RNA也应用于RNA的转运。在这篇综述中,将会介绍用于实现RNA稳定性,转运和扩增各种方法。并且也会讨论到最新的RNA类药物和疫苗的进展。这篇综述将会集中论述mRNA和RNA病毒类药物和疫苗而不会涉及寡核苷酸类治疗方法。

 一、RNA稳定性的提升

 由于单链RNA(ssRNA)对降解的敏感性,我们为了提高RNA分子的稳定性做了很多努力。包括将经过证实具有稳定mRNA分子和启动翻译的序列进行改造。并且化学改造核苷也可以增强对降解的抵抗。

 1、帽结构

 5‘端7-甲基鸟苷三磷酸(m7G)的帽结构对RNA稳定性起到很关键的作用。尽管帽结构已经应用于体外RNA转录,但因帽结构反向匹配结合后导致不能有效的转录生成mRNAs依然是一个问题。用只有一个3’-OH群的抗反向帽结构(ARCAs)来代替两个3’-OH群的帽结构就可以防止反向匹配结合的问题。与传统帽结构相比,应用ARCAs使RNA 转录效率提高了两倍以上。并且,有ARCAs帽结构的体外转录RNA转染进入细胞后RNA表达蛋白质的持续时间和水平都有明显提高。由于无法到达100%的加帽率,转录后再加帽结构的方法已经被应用来提高未加帽结构RNA的翻译效果。近期研究发现一些细菌RNA 片段在5’末端也有类似真核细胞RNA帽结构的结构。并且在革兰阴性和革兰阳性细菌中都发现了5’端的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和3‘端的脱磷辅酶(dpCoA),我们假设脱氢NAD+(NADH)和dpCoA在RNA转录起始后像帽结构一样被加在RNA上的。然而,最新的研究表明在NAD+,NADH, dpCoA 是在RNA转录起始阶段整合到RNA上的。它们被认为是在细胞RNA多聚酶(RNAP)重新启动转录的非经典核苷酸启动因子(NCINs)。并且细菌RNAP和真核细胞RNAPⅡ都整合了NCIN帽结构。NCIN帽结构的效率与DNA启动子上游及所处的转录起始点序列有关。而且NCIN帽结构在体内是功能序列。这些发现对未来更好的转运和表达RNA的稳定性有很大的助益。

 2、Poly(A)尾

 另一种稳定RNA分子的方法是在mRNAs3‘端加poly(A)尾。已经证实poly(A) 尾和5‘端m7G帽结构通过结合PABP起协同作用。PABP与真核细胞翻译启始因子eIF4G相互作用并和5’端m7G帽结构、真核细胞翻译启始因子eIF4E共同构成复合物。Poly(A)尾可以通过将含poly(A)尾基因的片段编辑在DNA模板上或利用重组poly(A)多聚酶在体外转录RNA完成转录后延长生成这两种方法加在mRNAs上。其中利用重组poly(A)多聚酶的方法缺点是生成的poly(A)尾的长度不一。相比之下,利用DNA模板生成的poly(A)尾因具有一定的长度从而成为最佳选择。就poly(A)尾的构建而言,已经证实了增加poly(A)尾的长度可以提高形成多聚体的效率同时也会影响蛋白质表达的水平。基于多个研究可以得出体外转录mRNAs最适宜poly(A)尾的长度在120-150个核苷酸左右。

 3、5’和3’端非翻译区

 非翻译区(UTRs)对基因表达的转录后调节起着非常重要的作用。它包括调节mRNA从核内的转运和翻译的效率,亚细胞定位和mRNA稳定性。并且,非翻译区,尤其是3‘端UTR的保守茎环结构和硒代胱氨酸插入序列也与mRNA中硒代胱氨酸密码子UGA翻译成硒代胱氨酸有关。从5‘端和3‘端插入非翻译序列就拥有了关键调节基团便可以优化体外mRNA的转录。alpha球蛋白3’端UTRs的整合经证实确有稳定mRNA的作用。况且5‘端和3’端的β球蛋白UTRs还可以提高翻译效率。球蛋白UTRs已经被应用于优化体外RNA转录包括RNA自体T细胞电穿孔技术和裸抗原编码的RNA结内注射技术。并且,被转染了抗原表达UTRs优化的RNA的树突状细胞(DCs)已经被用来免疫CMV阳性的个体和肿瘤病人了。

 4、化学改造核苷

 为了提高RNA的治疗效果,在RNA翻译后整合天然核苷已经在体外试验中证实可以有效地减少转录RNA引起的免疫反应。例如,由假尿苷改造过的体外转录mRNA可以提高RNA的稳定性和翻译效率。尽管RNA可以通过激活Toll样受体来刺激免疫系统,但是整合改造的核苷(甲基化或假尿苷)会降低其激活能力,最终导致树突状细胞(DCs)内细胞因子的严重下降和生物标记物低活性。因此这种方法会导致TLR3,TLR7,TLR8识别障碍并且诱发抗体外转录RNA的免疫反应。因此,为了增强和延长mRNA的翻译,高效液体色谱法纯化的体外转录mRNA被用于清除dsRNA污染物,这样可以减少type1IFN和炎症前细胞因子的产生。

 二、RNA转运

 难以实现有效的RNA转运的问题已经严重阻碍了RNA在药物和疫苗的发展。为此,许多方法都试图提高RNA的转运效率,主要包括优化注射法,基因枪转运法,鱼精蛋白浓缩法,RNA佐剂,多聚体和脂质体纳米粒子包裹RNA等方法。

 1、裸RNA

 最简单的应用包括肌内注射裸mRNA,最初在小鼠体内导致报告基因的表达。后来用癌胚抗原(CEA)mRNA免疫小鼠使其产生抗癌胚抗原抗体的免疫反应,让裸RNA应用可行性得以肯定。尽管在一系列动物模型研究中都可以诱发产生抗体和T细胞免疫反应,但因特异性RNA酶对RNA的迅速降解使这项技术应用受限。许多用于提高转运效率的办法都在实验中,包括应用基因枪将RNA直接注入细胞质中。由金粒子包裹的体外转录mRNA可以穿过细胞膜。在一个小鼠模型中用基因枪转录连接了EGFP(增强绿色荧光蛋白)的黑色素细胞自身抗原TRP2的mRNA诱导出了抗原特异性细胞和体液免疫反应并且为机体对抗B16黑色素瘤肺部转移灶提供了保护。另一种方法是鱼精蛋白浓缩的mRNA,它可以保护RNA免于降解,并且通过MyD88,TLR7和TLR8依赖的信号通路诱导免疫反应。浓缩鱼精蛋白用于刺激产生抗原特异性的IgG抗体并激活特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫反应。然而,给转移性黑色素瘤病人皮内注射浓缩鱼精蛋白mRNA在1/2的评价病人中是安全的并且提高直接免疫的T细胞的数量,而在1/7患有疾病的病人中有完全反应。

 2、佐剂和共刺激分子

 在许多疫苗应用中已经证实添加佐剂实质上可以增强免疫反应。已经发现裸mRNA自身就使一种佐剂因此它可以刺激免疫反应。其他分子例如鱼精蛋白,多聚体Ⅰ:CRNA和包含基序的CpG都有为mRNA类疫苗增强免疫反应的效果。其他方法主要是将CD40L,CD70, OX40L, GITR和CD83共刺激分子序列整合在mRNA上来进一步增强免疫反应。

 3、包裹RNA和靶向树突状细胞(DCs)

 为了增强RNA的转运率和稳定性,已经评价了许多包裹RNA转运方案。在这种情况下,阳离子脂质体如N-[1-(2,3二油氧基)丙醇]-N,N,N-三甲基氯化铵1(DOTAP)已经被应用于包裹RNA。纳米颗粒已经证实可保护mRNA免受核酶降解并可以增强细胞对mRNA的摄取。近期已经可以用pH依赖性多-(b-氨基酯)核心和磷脂壳制造出可完全降解的纳米粒子。有效的纳米粒子体内mRNA转运已经成功在动物模型中诱导产生了强烈的免疫反应。例如,由DOTAP脂质体包裹的OVA mRNA分子通过皮内注射进小鼠的耳廓保护其不受EG7-OVA细胞皮下肿瘤的侵害。潜在的粒子聚集导致的细胞内外基因转运减少现象或许可以解释为什么CTL(细胞毒性T细胞)对静脉内注射反应比皮内注射反应更强烈。同时也证实了整合有融合基因特性的辅助脂质体DOPE可以将CTL对DOTAP/DOPE包裹的mRNA的免疫反应相较于DOTAP脂质体包裹的mRNA的免疫反应提高4倍。将OVA mRNA和GM-CSF mRNA共转运可以增强CTL的免疫反应。相比之下,CD80和IL-2的协同刺激却并没有这种效果。另一个实验中选择用组织化脂质来运送mRNA。通过组织化脂蛋白复合物系统性转运黑色素瘤相关抗原MART1的mRNA可以特异性保护机体不受B16F10黑色素瘤的侵害。其中组织化脂蛋白复合物是由聚乙二醇化的组化聚赖氨酸和L-组氨酸-乙酰胺组成的。增强性的抗B16免疫反应是通过使用同时包含MART1和MART1-LAMP1的mRNAs获得的。

 树突状细胞(DCs)是专门的抗原呈递细胞,在刺激产生免疫反应的过程中起着非常重要的作用。因此靶向树突状细胞为增强体内免疫反应提供了可能。然而早期研究证明,树突状细胞不能很好的被脂质复合体转染。因此纳米颗粒就被用于增强靶向树突状细胞(DCs)的功能。说到肿瘤免疫,树突状细胞(DCs)可以被肿瘤相关抗原(TAAs)的mRNA或者整个肿瘤的RNA转染。转染了TAA mRNAs的树突状细胞(DCs)可以直接被用于研制疫苗而不需要利用病人特异的肿瘤细胞或抗原。这个方法的缺点一方面在于许多肿瘤缺乏特异性的TAAs另一方面在于并不是所有TAAs都可以诱导出有效的免疫反应,故选择特异性TAAs也是一个难题。许多有关TAA mRNAs的研究都诱导出了抗肿瘤免疫反应。例如,转染了前列腺特异性抗原(PSA)TAA mRNAs的树突状细胞(DCs)被用于治疗前列腺癌病人,其诱导出了PSA特异性T细胞免疫反应且大大降低了6/7病人体内的PSA水平。并且用CEA mRNA 转染的树突状细胞(DCs)诱导的免疫反应在胰腺癌病人中耐受良好,尽管只在1/4的病人体内诱导出了抗肿瘤免疫反应。另一个试验中,甘露糖组化脂质复合体纳米粒子被应用于提高树突状细胞(DCs)中mRNA的转染效果。静脉注射mRNA装载的人(11)-LPR100比无糖LPR100诱导树突状细胞表达EGFP效率高4倍。树突状细胞(DCs)转染效果提高与抑制B16F10黑色素瘤的生长和注射免疫MART1 mRNA装载的人(11)-LPR100后病人生存期延长现象都有关系。针对脑肿瘤,肺肿瘤,肾肿瘤和黑素色瘤等肿瘤,利用从病人体内获得的完整肿瘤RNA的方法已经进入临床试验阶段。在这种情况下,在大约1/3参加试验的脑肿瘤和神经母细胞瘤病人体内中观察到了临床反应。并且,在患有肾脏恶性肿瘤病人的试验中并未观察到剂量相关的毒性反应或自身免疫反应。

 三、自体扩增RNA

 单链RNA(ssRNA)病毒鉴于其可以自我复制的特性,被频繁应用于研发疫苗和肿瘤免疫治疗。所有RNA病毒中,α病毒,黄病毒,重组病毒及麻疹病毒已经作为RNA的转运和表达向量。下面简单介绍一下这些病毒。

 α病毒属于包膜病毒,包含一条正链RNA基因组和包膜结构。其中非结构基因nsP1-4,专门负责高效RNA复制,可以让RNA分子快速扩增而使正链RNA可直接在细胞质内翻译。在体内和体外试验中,复制率低的α病毒和复制率高的a病毒都被用于基因转运。并且这些病毒向量可以有多种形式的运用,如重组病毒颗粒,裸RNA复制子或层型RNA-DNA病毒矢量。同样,有着单正链RNA基因组的黄病毒和α病毒以同样的原理应用于肿瘤免疫治疗。相比之下,重组病毒和麻疹病毒是单负链RNA基因组,这使它们需要通过另一种方法来生成病毒矢量。但这并没有限制它们在疫苗研发或免疫治疗方面的应用。自体扩增RNA病毒矢量近来被广泛应用于感染性疾病和肿瘤疫苗的研制。例如,用重组库金病毒(黄病毒属)颗粒免疫多种动物模型已经证实对埃博拉病毒感染有保护作用。水泡性口炎病毒(VSV)(重组病毒属)委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)(α病毒属)可以表达埃博拉病毒的糖蛋白。并且,水泡性口炎病毒的糖蛋白颗粒已经进入了Ⅰ/Ⅱ期临床试验,这证实了它具有良好的安全性和埃博拉免疫原性。而用表达包膜蛋白域3(ED3)的麻疹病毒免疫的小鼠可以免受登革病毒的侵害。有趣的是,用miRNA序列的基因沉默方法已经被用于VEE,显示它可以在动物模型中下调VEE的复制。在另一个研究中,作为VEE复制的关键的VEE RNA依赖性RNA多聚酶,在靶向针对它的5种miRNA中有3种可以成功抑制VEE在BHK细胞中的复制。许多与肿瘤免疫相关的研究都证实了自体扩增RNA病毒可以诱发肿瘤退行性改变,延长生存期甚至在几种肿瘤的动物模型中起到保护作用。例如,库金病毒颗粒表达的GM-CSF使小鼠黑色素瘤模型发生了退行性改变。而表达PSCA(前列腺干细胞抗原)的VEE粒子在前列腺癌模型中表现出保护作用。在应用了SFV介导转运的神经特异性miR-124后在异种移植脑肿瘤的小鼠模型中得到了生存期延长的结果。有趣的是,仅一次肌内注射裸SFV-LacZ RNA就可以对患有CT26结肠癌的小鼠提供有效的保护。近期发现,用自体扩增RNA向量免疫可以在注射部位早期诱导产生大量的1型IFN和IFN免疫反应,这也许可以起到佐剂的效果或下调抗原表达。根据IFN受体敲除小鼠的研究,降低早期1型IFN反应可以有效提高自体扩增RNA向量的初始表达。另一个研究是与自体扩增复制子RNA和纳米科技结合相关的。用壳聚糖纳米粒子包裹复制子RNA大大提高了向树突状细胞(DCs)转运的效率也增强了诱导体内免疫反应的效果。并且,为了避免引起宿主对自体扩增RNA病毒的中间体dsRNA的免疫反应,编码保护病毒免疫入侵的蛋白E3,K3,B18的不可复制mRNA被一同转运进入体内。这个方法大大的抑制了蛋白激酶R和IFN通路的激活同时增强了自体扩增RNA的表达和转运。而针对有转移性去势抵抗性前列腺癌的病人应用由VEE颗粒介导表达的前列腺特异性膜抗原(PSMA)的Ⅰ期临床试验已经展开。在应用剂量为0.9×107或者0.36×108IU的VEE-PSMA颗粒后没有观察到毒性反应。尽管并没有获得PSMA特异性细胞免疫反应或临床效果,但产生的中和性抗体表明在实验中运用的剂量是可选的。关于将脂质体包裹的表达IL-2的SFV粒子应用于黑色素瘤和肾癌的病人的研究也进入了Ⅰ期临床试验。静脉注射使IL-2在细胞质内的水平提高了5-10倍,并可以持续5天。有了包裹的过程,SFV颗粒不能被宿主免疫系统识别,使病人可以反复接受注射。最大耐受计量被定为每平方米3×109个颗粒。

 RNA药物升级

 许多RNA类药物已经进入临床试验阶段。其中很大一部分是基于siRNA直接注射,脂质纳米颗粒和包裹病毒颗粒的转运方法。在这种情况下,在34个患有晚期实体肿瘤的病人身上进行了针对蛋白激酶N3的脂质体包裹siRNA的Ⅰ期临床试验。以10为单位的递增梯度剂量通过静脉注射进入病人体内同时用CT或MRI监测他们的反应。这种siRNA转运有很好的耐受性而且仅引起了很低的毒性反应。41%的病人病情都比较稳定,其中8个病人在病情稳定的基础上表现出部分或完全的转移灶退行改变。而且,针对心血管疾病和罕见肝病的Ⅰ期临床试验也获得了进展。目前,在慢性HBV感染者中针对通过脂质纳米颗粒转运的乙型肝炎病毒(HBV)的RNAi的Ⅱ期临床试验也取得了进展。利用针对半胱天冬酶2 mRNA的siRNAs来治疗非动脉性早期缺血性视神经通路疾病也进入了Ⅲ期临床试验。人们也致力于寻找针对肺癌的RNA类精准药物,也包括长效或短效用于诊断和治疗的非编码RNAs。生物标记物的临床试验可以为治疗肺癌提供更好的方法。Moderna 有许多针对流感病毒,寨卡病毒和企昆贡亚病毒等感染性疾病的mRNA类药物都在进行临床试验(主要是Ⅰ期临床试验)。

 RNA疫苗的进展

 RNA类疫苗最新的进展主要集中在脂质纳米颗粒包裹的RNA和自体扩增RNA病毒向量应用的方面。例如,核苷改造的寨卡病毒 prM和E糖蛋白RNA分子已经应用脂质纳米颗粒来包裹。单支低剂量皮下注射即可在小鼠及其它非人灵长类动物体内诱导产生强烈而持久的中和性抗体。在小鼠和非人灵长类动物体内诱导寨卡病毒保护性抗体的剂量分别是30微克和50微克。自体扩增RNA向量如昆金病毒和VEE也保护了注射致命病毒剂量的豚鼠不受埃博拉病毒的感染。同样,用能表达人猿免疫缺陷病毒gag-pol的昆金病毒颗粒免疫的小鼠可以免受人猿免疫缺陷病毒的侵害。至于RNA药物,通过确定肿瘤病人体内个体特异性肿瘤突变来生产的分子优化疫苗取得了巨大进步。在这种情况下,灵活的个体化肿瘤疫苗已经进入临床试验阶段。在结内应用合成RNA疫苗的基础上,由RNA脂质复合体纳米颗粒改造的第二代RNA疫苗已经进入临床试验。例如,RNA脂质复合体纳米颗粒(lipoMERIT)编码的侵袭性黑色素瘤共有肿瘤抗原免疫疗法已经在进行临床Ⅰ/Ⅱ期试验的检测。正在进行研究的预测数据显示在40多个病人身上都获得了良好的安全性和耐受性。疫苗诱导免疫反应阳性率很高而且多次注射Lipo-MERIT可以反复诱导产生抗原特异性免疫反应同时增强免疫前状态。

 结语和展望

 RNA类生物药物和疫苗在药物界是一个相对比较前沿的技术。但是,它们的应用范围极广,包括在糖尿病,肿瘤,结核,心血管疾病和感染性疾病等疾病预防性和治疗性的应用方面的潜能。尽管700多种RNA和DNA治疗性药物中大部分都处于临床前期研发阶段,只有小部分进入了临床试验,但据估测在2020年它将会占据12亿市值。全球目前有160家公司和65家科研团队涉猎RNA分子类的治疗方案。迄今为止至少有12种mRNA疫苗正在研发。并且相较于DNA类药物,RNA药物更具潜力。特别是之前研制的寡核苷酸类药物,对RNA病毒和mRNA基础上研制的药物和疫苗会大有助益。如今,对RNA类药物和疫苗来说,有关于毒性和药物转运的问题仍亟待解决,但近期通过RNA分子包裹和自体扩增RNA病毒的应用增强了RNA稳定性并解决了转运问题,让这类药物在未来药物发展成为可能。

 本文分享自生物制品圈《RNA类药物以及疫苗的研究进展》