mRNA-LNP制剂中缓冲体系的筛选与评估

上周，艾伟拓产品团队分享了非脂质药用辅料对mRNA-LNP制剂稳定性的影响。（参考阅读：《非脂质药用辅料对mRNA-LNP稳定性的影响及筛选考量》

本周，我们接着这个话题，通过一篇美国俄勒冈州立大学药学院的研究论文，进一步讨论缓冲体系对mRNA-LNP的影响，供大家参考

摘 要

该研究测试了三种常见生物缓冲液——HEPES、Tris和PBS——在单次冻融前后与DLin-MC3-DMA mRNA-LNP制剂的相容性。通过电子显微镜、差示扫描量热法和膜流动性分析发现，不同缓冲液使LNP形态发生了不同的结构变化。采用体外和体内模型测量mRNA转染效率，发现Tris或HEPES缓冲液中的LNPs具有更好的冷冻保护效果以及与PBS相比更高的转染效率

1.缓冲体系可能对LNP的性质与稳定性有较大影响

近年来，脂质纳米颗粒(LNPs)作为treat多种遗传疾病、疫苗和蛋白质替代疗法的非病毒核酸递送平台受到了wide—range关注。COVID-19mRNA-LNP疫苗的全球成功凸显了基于LNP的核酸递送潜力。

LNP配方的优化取决于混合方法，速率，使用的溶剂，pH值中和和纯化过程。

虽然LNPs通常被认为是凝聚态疏水材料，但它们可以捕获大量的水，这取决于LNP的组分和其包载的mRNA分子。mRNA-LNPs水分含量可以高达30%，这表明LNP制剂中缓冲体系的选择可能会对LNP的形成、性质和稳定性产生巨大影响，尤其是考虑到mRNA-LNPs溶液需要在零度以下的温度下长期储存的情况。

缓冲液在冷冻时的结晶会严重影响生物制剂的性质，并会导致LNP破裂和聚集，这在most近的报道中得到了证实。此外，缓冲液在冻结时的一个特殊性质是诱导产生pH梯度。例如，常用的磷酸缓冲盐溶液(PBS)在冷冻时可以经历多达4个单位的pH变化。常见的糖类冷冻保护剂如海藻糖、蔗糖等可以一定程度上抑制这些影响，但无法完全消除。

据报道，磷脂头部基团也会与缓冲体系相互作用，导致脂质膜软化。

因此，LNPs可能高度敏感于pH和膜弹性的动态变化，如缓冲体系类别、离子强度或温度变化。

2该研究中LNP配方及表征方法

将萤火虫荧光素酶(FLuc) mRNA用50 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4)和分子级水稀释，达到所需体积。将DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和DMG-PEG-2000溶解在总脂质浓度为5.5 mM的纯乙醇(摩尔比为50:10:38:1.5)中，以3:1的体积比(水/乙醇)和9 mL/min的总流速通过标准微流控混合制备LNPs。

制备用于透析的HEPES、Tris和PBS（详见下图a，Tris即为Tris Buffer，HBS即为HEPES Buffer），其盐度为150 mM, pH为7.4。配制后，立即将LNPs转移到10个kDa MWCO盒中，并在各自的缓冲液中以1000倍的体积透析4小时和过夜。透析后，LNPs在Amicon Ultra离心过滤装置中以3000g离心浓缩，分子量截止为100 kDa(Millipore Sigma, Burlington, MA)。

使用Zetasizer Nano ZSP对LNPs进行了水动力尺寸、多分散性指数和表面zeta电位的表征。对于Zetasizer分析，LNPs在各自的缓冲液中稀释，得到三次测量结果。为了量化mRNA的包封效率和浓度，采用了改进的Quanti-iT RiboGreen RNA(Invitrogen)方案。

3研究成果

3.1 缓冲液对LNP的形成和短期稳定性的影响可以忽略不计

通过标准的微流体混合程序制备含有FLuc mRNA的LNP。DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和DMG-PEG-2000脂质按50:10:38.5:1.5摩尔比混合，pH 4柠檬酸缓冲液中的mRNA溶液与乙醇脂质混合物的体积比为3:1，总流速为9 mL/min。然后将所得的LNP悬浮液分成三等份，分别与PBS、Tris或HEPES进行透析。

透析后，将LNPs浓缩，并通过动态光散射(DLS)和改进的核糖绿测定法进行分析。

DLS分析显示，三种缓冲液中LNPs颗粒大小几乎相同，约为70 nm，PDI约为0.05。

Zeta电位值表明，PBS和Tris配方的表面电荷略为负(约−3mV)，HEPES配方的表面电荷为中性，三种缓冲液中包封率均为>92%。

LNP的冷冻透射电镜显微照片也没有显示任何outstanding的形态变化，这表明缓冲液对LNP的形成、形态或短期稳定性的影响可以忽略不计。

3.2 低温冻存复溶后，不同缓冲液中LNP关键表征出现差异

在- 20℃下保存三周后，将不同缓冲溶液中的LNPs在室温下解冻30分钟，立即用于研究。

①粒径

储存在HEPES和PBS中的样品在FT后的平均粒径增大了约50%，而储存在Tris中的LNPs的粒径减小了约10 nm。

②PDI

HEPES和Tris中LNPs的PDI在冻融前后基本保持一致，而PBS中LNPs在解冻后PDI增加了3倍（上图b）。FT后Zeta电位也略有下降（上图d）。

③LNP形态

LNP形态受到冻融的严重影响，冷冻透射电镜证实PBS缓冲液中的 LNP在大小上most多样化，并且显示出高度异质性的内部组织，以及颗粒聚集。这可能是脂质相和水相分离所导致。具体而言，PBS中的LNP包含典型的100 nm以下的致密LNPs，100~150nm的空脂质体样结构，以及不同粒径包载水相的LNPs，其中部分水相中含有mRNA。

DLS分析显示，Tris中的LNPs尽管观察到形态变化，但尺寸和PDI没有明显变化，这表明相比于PBS，Tris可能可以更大程度地抑制LNPs颗粒的聚集。

与新鲜LNPs相比，HEPES中的LNPs在冻融后出现独特的沙漏状结构，尺寸略大(见下图e)。在LNPs周围形成的水泡似乎缺乏mRNA，这可能表明HEPES可以影响mRNA周围脂质的堆积，例如，HEPES可以促进脂质与mRNA之间更强的静电相互作用——HEPES LNPs的zeta电位是真正的中性的，而PBS和Tris LNPs具有−2至−5 mV的轻微负电荷，这可能表明当HEPES存在时，mRNA电荷的中和作用更有效。

此外，基于冷冻显微图像研究了脂质膜厚度的变化。

平均而言，脂膜厚度在FT后增加了15%，表明膜水合作用增加。

更具体地说，冷冻后，Tris LNPs的脂膜厚度增加了约0.8 nm, PBS增加了约0.6 nm, HEPES LNPs增加了约0.2 nm。尚不完全清楚这些改变是否表明脂质膜成分发生变化或onlyonly是水掺入的结果，但这些结果突出了解冻后LNPs的脂质膜发生了outstanding变化，且不同缓冲体系中变化程度不同。

以上实验结果表明，不同缓冲液对mRNA-LNPs的关键表征（形态、粒径、PDI，脂质膜厚度等）可以产生较大影响。

3.3 转染能力与内涵体逃逸的体外评估

①缓冲液影响LNP转染能力

该研究评估了不同缓冲液中的LNPs的转染能力和内涵体逃逸的程度。分别用包封FLuc mRNA的LNPs处理hela和HEK293T/17(后者用Gal9-GFP报告系统修饰)两个细胞系，并在24小时后检测。无论使用何种缓冲液，细胞存活率均保持在80%(下图a,c)。转染评价表明，缓冲液的转染效率随细胞系的不同而变化。在HeLa细胞中，LNPs转染趋势为HEPES＞PBS>Tris(下图b)，而HEK293T/17细胞表现出Tris>HEPES>PBS的偏好(下图d)。

一般来说，所有的mRNA-LNP制剂在解冻后转染效果都有所下降。在HeLa细胞中，PBS LNPs的转染效率下降most为严重，在所有处理中平均下降4倍，而HEPES在所有处理中平均下降2倍(下图b)。对于HEK293T/17细胞系, HEPES和PBS LNPs均无统计学意义的下降，而Tris在100和200 ng时的LNPs分别下降了2 ~ 2.5倍(下图d)。

②缓冲液影响内涵体逃逸效率

凝集素是一个与病原体入侵和免疫感知相关的糖结合凝集素家族。半乳糖凝集素如gal3、gal8和gal9从弥漫的细胞质表达重新分布到暴露的糖苷位点，这是由于内体内小叶暴露事件造成的，表明内涵体破坏。Gal9已被证明在报告细胞内涵体逃逸的检测中具有most高的信噪比。因此，可利用Galectin 9 (Gal9)- gfp 修饰的HEK293T/17细胞系，评估FLuc mRNA LNPs的内涵体逃逸情况。

低剂量处理(50 ng)在所有新鲜LNPs中几乎没有变化，HEPES LNPs在FT后表现出most高的Gal9募集和mostoutstanding的变化(2.6倍)。

高剂量(200ng)处理组中，冷冻前Tris LNPs诱导了most高的Gal9募集。不同缓冲体系中的LNP对FT的反应完全不同。PBS LNP减少了Gal9的招募，Tris LNPs几乎没有变化，HEPES LNPs增加了Gal9的招募。解冻后的HEPES LNPs内涵体逃逸的增加可能是低温透射电镜观察到的形态学变化的结果。LNP形态的变化导致体外转染的增加，因此HEPES可能促进了解冻后LNP形态的有利变化。

这些体外实验数据进一步支持了LNP缓冲液组成对冻融后转染效率的重要性，并揭示了细胞摄取的差异受到这些变化的影响。

3.4 体内成像评估mRNA表达情况

通过living body成像，探索了不同缓冲体系mRNA-LNP在体内的表达情况。将HEPES、Tris和PBS LNPs静脉注射到年龄匹配的雌性BALB/c小鼠中，比较荧光素酶的表达水平和apparatus特异性。在注射后4和24 h时间点测量新鲜和解冻的LNPs的生物发光信号。

在所有案例中，生物发光图像显示强烈的肝脏转染模式，与通常的LNP静脉注射制剂一致。

总体而言，HEK293T/17细胞系的体内转染趋势与体外观察到的相似(Tris > HEPES > PBS)。新鲜LNPs之间的交叉比较得出结论，与其他缓冲液相比，Tris组在给药后4小时增加了2倍。这种功效的增强可能是由于脂质膜上的水置换改善了apoe介导的摄取，正如脂质膜厚度减少所表明的那样。

然而，缓冲液导致了不同程度的转染损失。对于给药后4小时的FT组，HEPES显示总通量减少约2倍，Tris显示减少约3倍，PBS (LNP配方中most常见的缓冲液)导致总通量减少近9倍。

有趣的是，在24小时时间点，不同缓冲液样品之间mRNA表达水平没有统计学上的outstanding差异。这可能是LNPs在血液中不断循环，缓冲液作用减弱的结果。

总的来说，与先前的观察结果一致，mRNA的传递受到冻融过程的影响。缓冲液对体内给药效果的巨大影响表明，在LNP制备中选择适宜的生物缓冲液，或可为保持mRNA-LNP的理化性质及生物学活性提供outstanding优势。

4

结论

脂质纳米颗粒（LNP）通常通过透析或与生理缓冲液(如PBS)交换缓冲液来中和，纯化后可直接注射入生物体。此外，缓冲体系可以作为冷冻保护剂，减轻LNP制剂在低温储存时的稳定性问题。

值得注意的是，FDA批准的COVID-19疫苗Spikevax和Comirnaty使用不同的缓冲液，这表明不同的mRNA-LNP制剂可能对缓冲体系有不同的要求。（笔者注：Comirnaty上市后制剂prescription中缓冲体系由PBS变更为了Tris，详细信息请参考：《Moderna：使用TRIS缓冲体系可提高mRNA稳定性》）

因此，为LNP制剂筛选适宜的缓冲体系是一个极具价值的研究课题。然而，缓冲体系对LNP的结构形态、包封率和转染效率方面的作用迄今尚未得到充分研究。

本文分享的研究中，使用常用阳离子脂质DLin-MC3-DMA制备mRNA-LNP，在-20℃低温冷冻3周，比较了LNP冻存前后的理化性质和生物学活性（体外+体内）。

结果表明，通过体外和体内转染衡量，在HEPES和Tris体系中的LNPs总体上优于PBS。与PBS相比，HEPES和Tris作为冷冻保护剂，可以在更大程度上保存LNPs的结构和mRNA的递送效率。

此外，储存在HEPES中的LNPs在FT循环后形成了独特的沙漏状结构，而Tris和PBS在冻融后都产生了高度聚集的结构。因此，HEPES可以为LNPs提供更好的保护，防止pH梯度急剧下降，防止LNP聚集，most终控制相分离过程。另一方面，使用Tris对转染特别有益，这表明缓冲盐等辅料在LNP制剂中的作用可能被much低估了。

通过分享该研究，艾伟拓产品团队希望揭示LNP制剂prescription研发过程中，缓冲体系选择的重要性，希望能够为广大核酸递送企业及相关从业者带来一定的参考。

未来，艾伟拓产品团队也会持续关注核酸递送制剂prescription相关研究进展，包括不同剂型（如冻干剂型）、不同存储条件（如2~8℃冷藏存储）、不同LNP脂质组分及不同载荷等因素对LNP制剂辅料选择的影响。

下一期，艾伟拓产品团队将为您带来《冷冻或冻干导致pH值变化及对应缓冲体系筛选考量》，敬请期待！

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