《mRNA-LNP疫苗的结构与稳定性》文献解读系列六

LNP稳定性

除了mRNA 的完整性外，LNP 的稳定性对于 mRNA-LNP 疫苗的质量也至关重要。目前的mRNA疫苗没有披露关于LNP 稳定性测试的数据，但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制剂保存在2~8°C 之间时具有三年的有效期，同时该产品不能冷冻保存。

Onpattro 的LNP 系统的组成是：可电离的阳离子脂质DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇、PEG2000-C-DMG（见表 1）（摩尔比 50:10:38.5:1.5），它们在组成上类似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一项siRNA-LNPs 的研究中用类脂质306O 13代替DLin-MC3-DMA，样品水溶液在 2°C 、pH 7 的环境下下能稳定储存156 天，其粒径和siRNA包封率没有明显变化。Suzuki 等人的补充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 环境下稳定储存1.5。总之，这些数据都表明是mRNA 的不稳定，而不是 LNP 的不稳定，导致了当前mRNA-LNP疫苗的储存条件严苛和保质期短。

Fan等人总结了脂质体和 LNP的稳定性及其质量属性。LNP 可以承受化学和物理不稳定性，化学不稳定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂质的降解。脂质氧化可能发生在不饱和脂肪酸部分（Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在该问题）和胆固醇，氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基团存在杂质导致的结果。除此之外，氧化性杂质也可能导致包封的mRNA 氧化。脂质例如 DSPC 和可电离的阳离子脂质中的羧酸酯键容易受温度和pH依赖性的水解的影响（图 6）。

LNP 稳定性的另一个关键因素是物理稳定性，主要有三种类型的物理不稳定性：包封的药物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在储存和流通过程中容易发生 LNP 的聚集，所以为了增加稳定性，LNP 中通常添加PEG化脂质，LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。

另一种类型的物理不稳定性主要由于mRNA 的泄漏，这主要影响包封产品的稳定性。值得注意的是，包封率通常 > 90%，并且尚未报道过在储存期间出现mRNA泄露（用RiboGreen监测）的情况。未包封的mRNA（“裸露的mRNA”）几乎不会被细胞摄取；而且它会迅速被降解，因此无法用于翻译。

图6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂质。

由于注射 mRNA-LNP疫苗时的超敏反应可能与PEG化脂质有关，因此，已经研究了防止聚集体形成的替代脂质。使用多聚肌氨酸修饰脂质能使脂质递送系统更加稳定，在防止LNP聚集的同时能够减少超敏反应。但是目前仍然需要更多的实验来确定这种 PEG化脂质替代品是否能真正的提高 mRNA 的稳定性（例如不含过氧化物，注：目前使用的PEG脂质由于工艺原因，会有一定的过氧化物杂质，这会引起LNP中其他含有不饱和键的脂质和mRNA的氧化降解）。

分析 LNP 稳定性

Fan 等人在前面提到的文章中对监测 LNP 稳定性的分析方法进行了专业评估。我们推荐感兴趣的读者可以查看相关文献。

mRNA-LNP中哪个成分更不稳定？

迄今为止，已有几项研究考察了在储存期间稳定 mRNA 和稳定 LNP 的方法。然而，两者之中哪一个才是mRNA-LNP稳定性的瓶颈？当mRNA-LNP 制剂未冷冻时，是mRNA 降解？还是 LNP 降解导致稳定性问题？还是 mRNA 与 LNP 的组合？

与mRNA-LNP 系统相比，包封化学修饰且高度稳定的siRNA 分子（例如 Onpattro）的LNP系统具有更长的有效期。这表明当前的稳定性瓶颈不是 LNP，而是 mRNA。

迄今为止，公开资料还没有披露关于 mRNA-LNP 制剂中 mRNA 和 LNP 完整性的研究报告。在研究存储效果的少数研究中，例如 Zhang等人的研究，并没有考察长期储存的稳定性。因此，我们将首先研究裸露的mRNA的长期稳定性，但需要注意的是，这可能与包封在 LNP中的 mRNA 的稳定性有所不同（见下文）。

在Pascolo等人的综述中，裸露的mRNA的水溶液在无RNase的情况下只能在4°C下储存几天。这似乎符合目前对 mRNA 不稳定性的看法。目前关于裸露的mRNA长期稳定性的研究表明，mRNA 需要冷冻或干燥才能保持更长时间的稳定。

Roesler等人2009年的研究表明，编码荧光素酶的mRNA 在无RNA酶存在的条件下，分别以液体或冻干形式在室温下储存，表达效率分别在第8天和第16天开始出现降低，冻干辅料和冻干工艺方面未经优化（见图 7）。同时本研究无法得出关于2-8℃温度下长期储存稳定性的结论，因为稳定性研究只考察了32 天。

Wayment-Steele等人经过基于理论降解速率计算，预测 长度为4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的条件下，存储的半衰期为 941 天。他们注意到较长的mRNA序列，例如SAM，更容易发生水解。由于这是jin基于水解降解动力学的理论计算结果，可能会低估 了mRNA的实际降解速率，例如，当存在痕量RNase时，必须对 mRNA 的稳定性进行更多研究才能知道mRNA实际存储的稳定性情况。

图7 通过转染BHK-21细胞中荧光素酶表达效率分析mRNA在水中的稳定性

这些研究表明，在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 稳定。然而，应该重申的是，这两种成分的稳定性考察结果可能与LNP包封mRNA 的情况不同。如前几节所述，mRNA 与可电离的阳离子脂质、胆固醇和水一起位于 LNP 核内部（参见图 4）。这意味着 mRNA 处于水性环境中，因此容易发生水解，其水解的机制可能与溶液中 mRNA水解 的机制相似。然而，另一方面，LNP 内的 mRNA 可能通过疏水、氢键和/或静电相互作用被可电离的脂质包裹。在这种情况下，mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更稳定。在没有进一步研究的情况下，只能得出结论，mRNA 的不稳定性导致了储存条件苛刻。 

储存条件不同的原因

当前 mRNA 疫苗的另一个有趣方面是，不同厂家疫苗报告的储存温度和相应的“有效期”差异很大：从 -80°C 到 2-8°C，从几天到几个月。是否因为mRNA 疫苗处的不同导致这种储存条件的差异？又或者，储存条件的差异是否与热稳定性测试结果相关或更可靠的方法有关？这些信息很重要，因为深入了解对稳定性产生积极影响的因素可能是未来设计热稳定mRNA 疫苗的关键突破点。

Acuitas Therapeutics的首席执行官Tom  Madden 曾经在采访中表示，Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的稳定性。后者是否有可能使用更保守的方法来确保稳定性？尽管如此，目前必须在 -60 至 -80 °C 之间储存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的温度和冷藏条件下进行了稳定性考察，正如CureVac 科学家所做的那样。

此外，稳定性测试中的分析技术在灵敏度上可能不同，验收标准也可能不同。疫苗稳定性研究报告的发布可能对这些疑问作出回答，对此进行比较研究会是很有趣的工作。

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