没有脂质递送，就没有mRNA疫苗

2019年，病毒凶猛，短时间重创全球。病毒COVID-19通过刺突蛋白S蛋白S1亚基的受体结合位点（RBD）与受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合介导进入细胞内部。针对这些，各国相继加入疫苗的研制。

2020年，60多个候选疫苗批准进入临床试验,其中mRNA核酸疫苗等疫苗获批紧急使用或附条件上市。与传统疫苗相比,mRNA疫苗有很多优势,如制备安全、高效及质量可靠。脂质递送技术应用于mRNA疫苗，mRNA疫苗只是脂质包裹的一段mRNA分子，其中的mRNA分子进入人体后只是把携带的抗原信息传递出去，表达出抗原棘突蛋白。

现在全球已经有多家企业正在进行mRNA疫苗的研发。脂质递送技术也将获得更快发展。下面我们将对mRNA的研制难点，制备工艺及主要辅料等作一个简要的介绍。

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mRNA**疫苗研制的主要难点

mRNA疫苗的研制面临三个主要难点:

1.1.mRNA非常脆弱，特别不稳定，非常容易降解。日常环境和身体中有很多酶能够迅速将它们降解。mRNA的不稳定对于药物递送是困难的。

1.2.mRNA在体内的有效靶向递送。

1.3.mRNA链是一个带有负电荷的长链大分子。在人体的细胞表面有一层也带有负电荷的细胞膜， mRNA很难穿过细胞膜达到细胞内部。

上述三个难点，脂质递送技术均能有效解决。脂质递送技术可以保护mRNA，防止降解，帮助它们进入人体细胞，有效靶向递送，协助它们指导细胞生成病毒蛋白。可以说没有脂质递送技术，就没有mRNA疫苗。

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脂质递送技术简介

截至目前，脂质载体已成为递送 mRNA 为有效的非病毒载体。用于递送 mRNA 的脂质载体主要包括阳离子脂质体复合物 (lipoplex，LP)、脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle，LNP) 、纳米结构脂质载体(NLC)等，其中以脂质体纳米粒LNP应用的*为**。对于脂质体递送 mRNA 来说，不同的给药途径对诱导蛋白表达、给药频率及副作用强度具有重要影响。如 LNP 递送可通过改变给药途径来改变 mRNA 体内表达量和持续时间，其中肌注和皮内注射显示出比静脉注射更持久的蛋白表达。有文献报道mRNA-LNP 的外壳是单层的，但也有学者提出mRNA-LNPs 的外壳由一个或多个双层组成，可见目前的技术评估mRNA-LNP 壳的性质是困难的，可能存在多种类型的mRNA-LNP 结构，这取决于脂质的性质和mRNA-LNP 的制备方法。脂质体纳米粒 LNP外壳由不同的脂质组成，每种脂质都发挥着不同的功能，LNP表面主要是中性脂质和PEG化脂质以及部分可电离的阳离子脂质和胆固醇。在**内部，存在可电离的阳离子脂质、胆固醇（取决于其浓度）、水和 mRNA 的主要部分。

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脂质递送技术在mRNA疫苗中的应用

mRNA 疫苗中，mRNA（信使核糖核酸）被包裹在脂质递送技术中，其为 mRNA 提供保护，并将其安全递送至人体细胞，使其在细胞中释放，使疫苗起效。通过非共价亲和力和细胞膜结合和内吞被摄取，进入细胞后 mRNA 逃离内吞小泡，被释放到细胞质中表达靶蛋白， BioNTech等均采用LNP技术。脂质递送也叫脂质体包埋，相当于一个基因疗法的变体，这个技术辉瑞疫苗包埋的完整性**只有75%，必须用**温冷藏。

LNP技术平台的其中一个关键辅料是可离子化的脂质。脂质传递系统的可离子化脂质的极性随着pH值的变化会改变，在低pH值的环境中，它携带正电荷，这让它们可以与mRNA形成复合体，起到稳定mRNA的作用。在生理pH值时，是中性，减少了它的毒副作用。在脂质传递系统的**，还包裹着聚乙二醇修饰的脂质分子（PEGylated lipid），聚乙二醇（PEG）的修饰，它防止脂质体聚集在一起，控制脂质体颗粒的大小，可起到防止脂质体被人体的免疫系统发现的作用。脂质传递系统中还包含胆固醇和其它辅助脂质分子，协助构成脂质传递的完整结构。脂质传递系统在碰到细胞膜时会被细胞吞入到细胞内形成称为内体（endosome）的囊泡。在细胞内部，内体的pH值会降低，导致可离子化的脂质分子携带正电荷，改变脂质传递系统的构象，促使mRNA从内体中解脱出来，与负责生产蛋白的核糖体结合，指导病毒蛋白的合成了。

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mRNA疫苗的制备工艺

基于 mRNA 疫苗的研发，脂质递送技术已经被证实是用来递送 RNA 药物、疫苗的有效载**式。LNP含有多种成分，如何精确控制其组分、粒度、流量、形态等参数，同时还能确保质量，加快生产，这可能是 mRNA 疫苗生产**的难点。传统的脂质体生产方法，比如乙醇注入法、T型混合法、薄膜分散法、逆向蒸发法、化学梯度法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等，但是这些方法收率低，包封率低，难以用于大批量生产。有文献报道采用冲击式射流混合法可以实现大生产，利用 BlueShadow 80P 高压泵，让疫苗和脂质溶液形成两股射流，在腔体中进行对冲，利用流体动力学让脂质各个组分充分地混合，形成包裹mRNA的纳米脂质体颗粒。生产设备碰撞喷射混合器安装在洁净间（C级）内。通过中控平台控制工艺步骤中所有单元的流量。所有单元安装在不锈钢框架内，以适应药品生产中的 CIP清洁程序。该系统包括：KNAUER 碰撞喷射混合器（IJM)， 脂质/乙醇混合物和 mRNA/缓冲液混合物的入口管路，脂质体出口管路，CIP在线清洁系统和不锈钢框架。

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mRNA疫苗关键辅料

mRNA疫苗其辅料中的关键成分为构成LNP的脂质材料，其中包括阳离子脂质体，PEG化脂质体等，解决了mRNA大分子、不稳定、易降解的困难，并实现了mRNA有效地胞内递送。大部分脂质材料以进口为主，国内只有少量品种生产， 其中AVT 公司为国内主流脂质代理商。AVT 累计已经有多个在脂质体制剂中有所应用的磷脂类辅料在CDE获得了公示，DMG-PEG2000，胆固醇（供注射用），DLin-MC3-DMA，蔗糖（供注射用），海藻糖Hipo-S （供注射用），DSPE-MPEG2000（药用注射级）等脂质体递送关键辅料都有供应。目前 mRNA 疫苗的结构具有有不同的分子和配比结构，但辅料基本相同，主要包括以下几种：

5.1.阳离子脂质：与带负电的 mRNA 结合，可高效包载核酸药物，同时提供正电荷，与带负电荷的mRNA复合，有助于内涵体逃逸，mRNA体内转染，可离子化脂质具有pH敏感性。

5.2.胆固醇：稳定LNP结构；调节膜流动性，提高粒子稳定性。

5.3.辅助型脂质：常用DOPE，稳定粒子，破坏内涵体体稳定性，提高核酸递送效率

5.4.聚乙二醇化磷脂，延长代谢时间，提高粒子稳定性。减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间。

5.5.蔗糖，供注射用，提高LNP稳定性和mRNA疫苗的稳定性，防止脂质黏性过大。

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mRNA疫苗脂质递送技术生产实例

mRNA疫苗非活性成分：

一：LNP技术，膜骨架DSPC,阳离子脂质ALC-0315,PEG化脂质ALC-0159,胆固醇；蔗糖；盐类，氯化钾，氯化钠，磷酸二氢钾，二水合磷酸氢二钠。

二：LNP技术，膜骨架DSPC,阳离子脂质SM-102,PEG化脂质PEG2000-DMG,胆固醇；蔗糖；缓冲盐类，氨丁三醇，氨丁三醇盐酸盐，醋酸，醋酸钠。

辉瑞-BioNTech疫苗工艺过程：

原液制备：疫苗复杂生产一般从开始到结束为60天，其中30天用于测试。每月生产2-3亿支。细菌培养产生称为质粒的DNA环，其中包含冠状病毒基因。从主细胞库中提取质粒瓶，融化。经改造的大肠杆菌，将质粒带入细胞内。改造过的细菌被移至生长培养基中，然后在营养肉汤中发酵，每20分钟繁殖一次，并复制出需要的DNA质粒。化学法分解细菌，并从其封闭的细胞中释放出质粒。将质粒与先前的样品进行比较，确认冠状病毒基因序列没有改变，用酶切割并过滤，将纯化的DNA留在一升的瓶子中。每瓶将产生约150万剂。每个DNA瓶都被冷冻，使用酶将DNA转录成信使RNA或mRNA。测试所得的16升袋装的mRNA，将其冷冻。

脂质递送技术包裹：油性脂质体来保护mRNA并帮助其进入人体细胞。脂质体和mRNA的裸链通过碰撞喷射混合在一起，电荷将它们急速混合在一起，形成脂质体疫苗颗粒。

分装冷冻：每分钟575个小瓶的速度分装。疫苗冷藏为低温，但在装瓶过程中会快速升温，如果不在冷冻中的时间过长，mRNA将会变质。必须在短于46小时的时间将液态疫苗分装到小瓶中，马上进行深度冷冻。每195个装满的小瓶放置到一个小塑料托盘中，然后冷冻。

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疫苗脂质递送技术的展望

目前，****依然蔓延，mRNA疫苗也将发挥更大的作用。作为重要的载体脂质递送技术也将获得更多关注，其制备工艺、制备材料及表面修饰等方面也会取得了较大的进展。据报导欧洲有工厂已投巨资进行扩产疫苗用特殊脂质。国内目前全球共有 15款mRNA 疫苗在研，其中CuerVac、Moderna、BioNTech被称为“mRNA国际三巨头”。 在国内，多家本土公司也在开发mRNA疫苗中，据了解，国内已有 8 家研发型 mRNA 疫苗企业，有3家已经处于临床阶段了。国内脂质类辅料需求量将暴增，能促进脂质递送技术的发展，加快相关大生产工艺设备的研制，促进脂质递送关键辅料的国产化。

参考资料：

1.Without these lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. Retrieved April 27, 2021, from https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-delivery/Without-lipid-shells-mRNA-vaccines/99/i8

2. Let’s talk about lipid nanoparticles. Retrieved April 27, 2021, from https://www.nature.com/articles/s41578-021-00281-4

3.Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206.